Genética

Engenharia genética e clonagem

Engenharia genética e clonagem
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Biotecnologia é o uso de métodos artificiais para modificar o material genético de organismos vivos ou células para produzir novos compostos ou para executar novas funções. A biotecnologia tem sido usada para melhorar a pecuária e as culturas desde o início da agricultura, através da criação seletiva. Desde a descoberta da estrutura do DNA em 1953, e particularmente desde o desenvolvimento de ferramentas e métodos para manipular o DNA na década de 1970, a biotecnologia tornou-se sinônimo da manipulação do DNA dos organismos em nível molecular.

As principais aplicações desta tecnologia são na medicina (para a produção de vacinas e antibióticos) e na agricultura (para a modificação genética das culturas). A biotecnologia também tem muitas aplicações industriais, como a fermentação, o tratamento de derramamentos de óleo e a produção de biocombustíveis,

Manipulando Material Genético

Para realizar as aplicações descritas acima, os biotecnologistas devem ser capazes de extrair, manipular e analisar os ácidos nucleicos.

Revisão da estrutura do ácido nucleico

Para entender as técnicas básicas usadas para trabalhar com ácidos nucleicos, lembre-se que os ácidos nucleicos são macromoléculas feitas de nucleotídeos (um açúcar, um fosfato e uma base nitrogenada). Cada um dos grupos fosfato dessas moléculas tem uma carga negativa líquida. Um conjunto inteiro de moléculas de DNA no núcleo de organismos eucarióticos é chamado de genoma. O DNA tem duas cadeias complementares ligadas por ligações de hidrogênio entre as bases emparelhadas.

Ao contrário do DNA nas células eucarióticas, as moléculas de RNA deixam o núcleo. O ARN mensageiro (ARNm) é analisado com maior frequência porque representa os genes codificadores de proteínas que estão sendo expressos na célula.

Isolamento de Ácidos Nucleicos

Para estudar ou manipular os ácidos nucleicos, o DNA deve primeiro ser extraído das células. Várias técnicas são usadas para extrair diferentes tipos de DNA ( Figura ). A maioria das técnicas de extração de ácido nucleico envolve etapas para abrir a célula e, em seguida, o uso de reações enzimáticas para destruir todas as macromoléculas indesejadas.

As células são quebradas usando uma solução detergente contendo compostos tamponantes. Para evitar a degradação e a contaminação, macromoléculas como proteínas e RNA são inativadas usando enzimas. O DNA é então retirado da solução usando álcool. O DNA resultante, porque é composto de polímeros longos, forma uma massa gelatinosa.

Quatro tubos de ensaio são ilustrados, mostrando quatro etapas na extração do DNA. No primeiro, as células são lisadas usando um detergente que perturba a membrana plasmática. No segundo, o conteúdo celular é tratado com protease para destruir a proteína e RNase para destruir o RNA. No terceiro, os restos celulares são sedimentados em uma centrífuga. O sobrenadante (líquido) contendo o DNA é transferido para um tubo limpo. No quarto tubo de ensaio, o DNA é precipitado com etanol. Forma fitas viscosas que podem ser enroladas em uma vareta de vidro.
Este diagrama mostra o método básico usado para a extração do DNA.

O RNA é estudado para entender os padrões de expressão gênica nas células. O RNA é naturalmente muito instável porque as enzimas que quebram o RNA estão comumente presentes na natureza. Alguns são até secretados pela nossa própria pele e são muito difíceis de inativar. Semelhante à extração de DNA, a extração de RNA envolve o uso de vários tampões e enzimas para inativar outras macromoléculas e preservar apenas o RNA.

Eletroforese em gel

Como os ácidos nucleicos são íons carregados negativamente em pH neutro ou alcalino em um ambiente aquoso, eles podem ser movidos por um campo elétrico. Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar moléculas carregadas com base no tamanho e carga. Os ácidos nucleicos podem ser separados como cromossomos inteiros ou como fragmentos.

Os ácidos nucleicos são carregados em uma fenda em uma extremidade de uma matriz de gel, uma corrente elétrica é aplicada e moléculas carregadas negativamente são puxadas em direção à extremidade oposta do gel (a extremidade com o eletrodo positivo). Moléculas menores se movem através dos poros no gel mais rápido do que moléculas maiores; essa diferença na taxa de migração separa os fragmentos com base no tamanho.

Os ácidos nucleicos em uma matriz de gel são invisíveis até que sejam corados com um composto que lhes permita ser visto, como um corante. Fragmentos distintos de ácidos nucleicos aparecem como bandas a distâncias específicas do topo do gel (a extremidade negativa do eletrodo) que são baseadas em seu tamanho (Figura ).

Uma mistura de muitos fragmentos de tamanhos variados aparece como um esfregaço longo, enquanto que o DNA genômico não cortado é geralmente muito grande para passar pelo gel e forma uma única faixa grande no topo do gel.

A foto mostra um fundo preto com 9 bandas verticais cinzentas (faixas). Nessas bandas são bandas brancas horizontais ligeiramente embaçadas de diferentes espessuras e brilho. As faixas cinzas fracas nas bordas esquerda e direita têm muitas bandas horizontais, e as 7 no meio têm apenas algumas poucas, em posições diferentes.
São mostrados fragmentos de DNA de seis amostras corridas em um gel, corados com um corante fluorescente e vistos sob luz UV. (crédito: modificação do trabalho de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

Reação em Cadeia da Polimerase

A análise de DNA geralmente requer o foco em uma ou mais regiões específicas do genoma. Também envolve freqüentemente situações em que apenas uma ou algumas cópias de uma molécula de DNA estão disponíveis para análise posterior. Essas quantidades são insuficientes para a maioria dos procedimentos, como a eletroforese em gel.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica usada para aumentar rapidamente o número de cópias de regiões específicas do DNA para análises posteriores ( Figura). O PCR usa uma forma especial de DNA polimerase, a enzima que replica o DNA, e outras sequências curtas de nucleotídeos chamadas primers que baseiam o par em uma porção específica do DNA que está sendo replicado.

O PCR é usado para muitos propósitos em laboratórios. Estes incluem: 1) a identificação do proprietário de uma amostra de DNA deixada na cena do crime; 2) análise de paternidade; 3) a comparação de pequenas quantidades de DNA antigo com organismos modernos; e 4) determinar a seqüência de nucleotídeos em uma região específica.

Figura mostrando PCR em 4 etapas. Primeiro, a fita dupla de DNA é desnaturada a 95 graus Celsius para separar os fios. As duas fitas são então recozidas a aproximadamente 50 graus Celsius usando primers. DNA polimerase, em seguida, estende as novas vertentes a 72 graus Celsius. A quarta etapa mostra que esse procedimento ocorre muitas vezes, resultando em um aumento nas cópias do DNA original.
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é usada para produzir muitas cópias de uma seqüência específica de DNA usando uma forma especial de DNA polimerase.

Clonagem

Em geral, a clonagem significa a criação de uma réplica perfeita. Normalmente, a palavra é usada para descrever a criação de uma cópia geneticamente idêntica. Em biologia, a recriação de todo um organismo é chamada de “clonagem reprodutiva”. Muito antes de serem feitas tentativas de clonar um organismo inteiro, os pesquisadores aprenderam a copiar pequenos trechos de DNA – um processo que é chamado de clonagem molecular. .

Clonagem Molecular

A clonagem permite a criação de múltiplas cópias de genes, expressão de genes e estudo de genes específicos. Para obter o fragmento de ADN numa célula bacteriana numa forma que será copiada ou expressa, o fragmento é primeiro inserido num plasmídeo. Um plasmídeo(também chamado de vetor neste contexto) é uma pequena molécula de DNA circular que se replica independentemente do DNA cromossômico em bactérias.

Na clonagem, as moléculas de plasmídeo podem ser usadas para fornecer um “veículo” no qual inserir um fragmento de DNA desejado. Os plasmídeos modificados são geralmente reintroduzidos em um hospedeiro bacteriano para replicação. Conforme as bactérias se dividem, elas copiam seu próprio DNA (incluindo os plasmídeos).

O fragmento de DNA inserido é copiado junto com o restante do DNA bacteriano. Em uma célula bacteriana, o fragmento de DNA do genoma humano (ou outro organismo que está sendo estudado) é chamado de DNA estranho para diferenciá-lo do DNA da bactéria (o DNA hospedeiro).

Plasmídeos ocorrem naturalmente em populações bacterianas (como Escherichia coli ) e possuem genes que podem contribuir com características favoráveis ​​ao organismo, como a resistência a antibióticos (a capacidade de não ser afetado por antibióticos).

Os plasmídeos foram altamente projetados como vetores para a clonagem molecular e para a subsequente produção em larga escala de moléculas importantes, como a insulina. Uma característica valiosa dos vectores plásmicos a facilidade com que um fragmento de ADN estranho pode ser introduzido. Estes vectores plasmídicos contêm muitas sequências curtas de ADN que podem ser cortadas com diferentes enzimas de restrição normalmente disponíveis. As enzimas de restrição (também denominadas endonucleases de restrição) reconhecem seqüências de DNA específicas e as cortam de maneira previsível; Eles são naturalmente produzidos por bactérias como um mecanismo de defesa contra o DNA estranho. Muitas enzimas de restrição fazem cortes alternados nas duas cadeias de ADN, de tal modo que as extremidades cortadas t uma salicia de cadeia simples de 2 a 4 nucleicos. A sequência que é reconhecida pela enzima de restrição é uma sequência de quatro a oito nucleótidos que é um palíndromo. Como com uma palavra palíndromo, isso significa que a sequência lê o mesmo para frente e para trás. Na maioria dos casos, a seqüência lê o mesmo para frente em um fio e para trás no fio complementar. Quando um corte escalonado é feito em uma sequência como essa, as saliências são complementares ( Figura ).

Na parte A, a figura mostra um filamento de DNA semelhante a uma escada. Na parte B, o DNA é cortado em ambos os filamentos entre as duas guaninas. Na parte C, as duas cadeias foram separadas, deixando as extremidades coesivas complementares em cada um com nucleótidos não ligados 5 'a 3' G, A, T e C.
Neste (a) local de reconhecimento da enzima de restrição de seis nucleotídeos, observe que a seqüência de seis nucleotídeos lê a mesma na direção de 5 ‘para 3’ em uma fita, como na direção de 5 ‘para 3’ na fita complementar. Isso é conhecido como palíndromo. (b) A enzima de restrição rompe os filamentos de DNA e (c) o corte no DNA resulta em “extremidades coesivas”. Um outro pedaço de DNA cortado em cada extremidade pela mesma enzima de restrição pode se fixar a essas extremidades adesivas e ser inserido na abertura feita por este corte.

Como essas saliências são capazes de voltar por pontes de hidrogênio com saliências complementares em um pedaço de DNA cortado com a mesma enzima de restrição, elas são chamadas de “extremidades coesivas”. O processo de formar ligações de hidrogênio entre sequências complementares em cadeias simples para formar dupla DNA de fita é chamado de recozimento.

Para entender melhor esse assunto veja também:

A adição de uma enzima chamada DNA ligase, que participa da replicação do DNA nas células, une permanentemente os fragmentos de DNA quando as pontas se unem. Desta maneira, qualquer fragmento de DNA pode ser unido entre as duas extremidades de um DNA de plasmídeo que foi cortado com a mesma enzima de restrição ( Figura ).

Uma ilustração mostrando as etapas na criação de plasmídeos de DNA recombinante, inserindo-os em bactérias e, em seguida, selecionando apenas as bactérias que captaram com sucesso o plasmídeo recombinante. Os passos são os seguintes: tanto o ADN estranho como o plasmídeo são cortados com a mesma enzima de restrição. O local de restrição ocorre apenas uma vez no plasmídeo no meio de um gene para uma enzima (lacZ). A enzima de restrição deixa extremidades coesivas complementares no fragmento de DNA estranho e no plasmídeo. Isto permite que o ADN estranho seja inserido no plasmídeo quando as extremidades coesivas se ligam. Adicionando DNA ligase re-anexa os backbones de DNA. Estes são plasmídeos recombinantes. Os plasmídeos são combinados com uma cultura de bactérias vivas. Muitas das bactérias não tomam plasmídeos em suas células, muitos tomam plasmídeos que não têm o DNA estranho, e alguns pegam o plasmídeo recombinante. As bactérias que absorvem o plasmídeo recombinante não podem produzir a enzima a partir do gene em que o fragmento foi inserido (lacZ). Eles também carregam um gene para resistência ao antibiótico ampicilina, que estava no plasmídeo original. Para encontrar as bactérias com o plasmídeo recombinante, as bactérias são cultivadas em uma placa com o antibiótico ampicilina e uma substância que muda de cor quando exposta à enzima produzida pelo gene lacZ. A ampicilina irá matar qualquer bactéria que não tenha tomado um plasmídeo. A cor da substância não mudará quando o gene para lacZ contiver a inserção de DNA estranho. Estas são as bactérias com o plasmídeo recombinante que queremos cultivar. As bactérias que absorvem o plasmídeo recombinante não podem produzir a enzima a partir do gene em que o fragmento foi inserido (lacZ). Eles também carregam um gene para resistência ao antibiótico ampicilina, que estava no plasmídeo original. Para encontrar as bactérias com o plasmídeo recombinante, as bactérias são cultivadas em uma placa com o antibiótico ampicilina e uma substância que muda de cor quando exposta à enzima produzida pelo gene lacZ. A ampicilina irá matar qualquer bactéria que não tenha tomado um plasmídeo. A cor da substância não mudará quando o gene para lacZ contiver a inserção de DNA estranho. Estas são as bactérias com o plasmídeo recombinante que queremos cultivar. As bactérias que absorvem o plasmídeo recombinante não podem produzir a enzima a partir do gene em que o fragmento foi inserido (lacZ). Eles também carregam um gene para resistência ao antibiótico ampicilina, que estava no plasmídeo original. Para encontrar as bactérias com o plasmídeo recombinante, as bactérias são cultivadas em uma placa com o antibiótico ampicilina e uma substância que muda de cor quando exposta à enzima produzida pelo gene lacZ. A ampicilina irá matar qualquer bactéria que não tenha tomado um plasmídeo. A cor da substância não mudará quando o gene para lacZ contiver a inserção de DNA estranho. Estas são as bactérias com o plasmídeo recombinante que queremos cultivar. Para encontrar as bactérias com o plasmídeo recombinante, as bactérias são cultivadas em uma placa com o antibiótico ampicilina e uma substância que muda de cor quando exposta à enzima produzida pelo gene lacZ. A ampicilina irá matar qualquer bactéria que não tenha tomado um plasmídeo. A cor da substância não mudará quando o gene para lacZ contiver a inserção de DNA estranho. Estas são as bactérias com o plasmídeo recombinante que queremos cultivar. Para encontrar as bactérias com o plasmídeo recombinante, as bactérias são cultivadas em uma placa com o antibiótico ampicilina e uma substância que muda de cor quando exposta à enzima produzida pelo gene lacZ. A ampicilina irá matar qualquer bactéria que não tenha tomado um plasmídeo. A cor da substância não mudará quando o gene para lacZ contiver a inserção de DNA estranho. Estas são as bactérias com o plasmídeo recombinante que queremos cultivar.
Este diagrama mostra as etapas envolvidas na clonagem molecular.

Plasmídeos com DNA estranho inserido neles são chamados de moléculas de DNA recombinante porque contêm novas combinações de material genético. Proteínas que são produzidas a partir de moléculas de DNA recombinante são chamadas de proteínas recombinantes . Nem todos os plasmídeos recombinantes são capazes de expressar genes. Os plasmídeos também podem ser manipulados para expressar proteínas apenas quando estimulados por certos factores ambientais, para que os cientistas possam controlar a express das proteínas recombinantes.

Clonagem Reprodutiva

A clonagem reprodutiva é um método usado para fazer um clone ou uma cópia idêntica de um organismo multicelular inteiro. A maioria dos organismos multicelulares passa por reprodução por meios sexuais, o que envolve a contribuição do DNA de dois indivíduos (pais), tornando impossível gerar uma cópia idêntica ou um clone de um dos pais. Avanços recentes em biotecnologia tornaram possível clonar reprodutivamente mamíferos em laboratório.

A reprodução sexual natural envolve a união, durante a fertilização, de um espermatozoide e um óvulo. Cada um desses gametas é haploide, o que significa que eles contêm um conjunto de cromossomos em seus núcleos. A célula resultante, ou zigoto, é então diploide e contém dois conjuntos de cromossomos. Esta célula divide-se mitoticamente para produzir um organismo multicelular.

No entanto, a união de apenas duas células não pode produzir um zigoto viável; Existem componentes no citoplasma da célula do óvulo que são essenciais para o desenvolvimento inicial do embrião durante as primeiras divisões celulares. Sem estas disposições, não haveria desenvolvimento subsequente. Portanto, para produzir um novo indivíduo, é necessário um complemento genético diploide e um citoplasma do ovo.

A abordagem para produzir um indivíduo artificialmente clonado é pegar o óvulo de um indivíduo e remover o núcleo haploide. Então, um núcleo diploide de uma célula do corpo de um segundo indivíduo, o doador, é colocado no óvulo. O óvulo é então estimulado a se dividir para que o desenvolvimento prossiga. Isso parece simples, mas, na verdade, são necessárias muitas tentativas antes que cada uma das etapas seja concluída com êxito.

O primeiro animal agrícola clonado foi Dolly, uma ovelha que nasceu em 1996. A taxa de sucesso da clonagem reprodutiva na época era muito baixa. Dolly viveu por seis anos e morreu de um tumor no pulmão ( Figura ). Houve especulações de que, como o DNA celular que deu origem a Dolly veio de um indivíduo mais velho, a idade do DNA pode ter afetado sua expectativa de vida. Desde Dolly, várias espécies de animais (como cavalos, touros e cabras) foram clonadas com sucesso.

Houve tentativas de produzir embriões humanos clonados como fontes de células-tronco embrionárias. No procedimento, o DNA de um humano adulto é introduzido em um óvulo humano, que é então estimulado a se dividir.

A tecnologia é semelhante à tecnologia usada para produzir Dolly, mas o embrião nunca é implantado em uma mãe substituta. As células produzidas são chamadas de células-tronco embrionárias, porque elas têm a capacidade de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células, como células musculares ou nervosas.

As células-tronco poderiam ser usadas para pesquisar e, finalmente, fornecer aplicações terapêuticas, como a substituição de tecidos danificados. O benefício da clonagem nesse caso é que as células usadas para regenerar novos tecidos seriam uma combinação perfeita para o doador do DNA original. Por exemplo,

CONEXÃO VISUAL
A ilustração mostra as etapas da clonagem da ovelha chamada Dolly. Um óvulo enucleado de uma ovelha é fundido com uma célula mamária de outra ovelha. Esta célula fundida divide-se então ao estágio do blastocisto e é colocada no útero da ovelha substituta, onde se desenvolve no cordeiro, Dolly. Dolly é o clone genético do doador de células mamárias.
Dolly, a ovelha, foi o primeiro animal agrícola a ser clonado. Para criar Dolly, o núcleo foi removido de um óvulo de um doador. O óvulo enucleado foi colocado ao lado da outra célula, depois eles ficaram chocados para se fundirem. Eles ficaram chocados novamente para começar a divisão. As células foram divididas por vários dias até que um estágio embrionário inicial fosse alcançado, antes de ser implantado em uma mãe substituta.

Por que Dolly era uma Finn-Dorset e não uma ovelha Scottish Blackface?

Engenharia genética

Usando tecnologia de DNA recombinante para modificar o DNA de um organismo para alcançar características desejáveis ​​é chamado de engenharia genética . A adição de DNA estranho na forma de vetores de DNA recombinante que são gerados por clonagem molecular é o método mais comum de engenharia genética.

Um organismo que recebe o DNA recombinante é chamado de organismo geneticamente modificado (OGM). Se o DNA estranho que é introduzido vem de uma espécie diferente, o organismo hospedeiro é chamado de transgênico . Bactérias, plantas e animais foram geneticamente modificados desde o início dos anos 1970 para fins acadêmicos, médicos, agrícolas e industriais. Essas aplicações serão examinadas em mais detalhes no próximo módulo.

Embora os métodos clássicos de estudar a função dos genes tenham começado com um determinado fenótipo e determinado a base genética desse fenótipo, as técnicas modernas permitem que os pesquisadores comecem no nível da sequência de DNA e perguntem: “O que esse gene ou elemento de DNA faz?”

Esta técnica, chamada genética reversa, resultou na reversão da metodologia genética clássica. Um exemplo desse método é análogo a danificar uma parte do corpo para determinar sua função. Um inseto que perde uma asa não pode voar, o que significa que a função da asa é voar. O método genético clássico compara insetos que não podem voar com insetos que podem voar, e observa que os insetos não-voadores perderam asas.

Da mesma forma, em uma abordagem de genética reversa, a mutação ou a eliminação de genes fornece aos pesquisadores pistas sobre a função do gene. Alternativamente, a genética reversa pode ser usada para fazer com que um gene se expresse demais para determinar quais efeitos fenotípicos podem ocorrer.

Resumo da seção

Os ácidos nucleicos podem ser isolados a partir de células para fins de análise posterior, abrindo as células e destruindo enzimaticamente todas as outras macromoléculas principais. Cromossomos fragmentados ou inteiros podem ser separados com base no tamanho por eletroforese em gel.

Pequenos trechos de DNA podem ser amplificados por PCR. O DNA pode ser cortado (e subsequentemente re-unido) usando enzimas de restrição. As técnicas moleculares e celulares da biotecnologia permitem aos pesquisadores manipular geneticamente organismos, modificando-os para alcançar características desejáveis.

A clonagem pode envolver clonagem de pequenos fragmentos de DNA (clonagem molecular) ou clonagem de organismos inteiros (clonagem reprodutiva). Na clonagem molecular com bactérias, um fragmento de DNA desejado é inserido em um plasmídeo bacteriano usando enzimas de restrição e o plasmídeo é absorvido por uma bactéria, que então expressará o DNA estranho.

Utilizando outras técnicas, genes estranhos podem ser inseridos em organismos eucarióticos. Em cada caso, os organismos são chamados de organismos transgênicos. Na clonagem reprodutiva, um núcleo doador é colocado em um óvulo enucleado, que é então estimulado a se dividir e se desenvolver em um organismo.

Nos métodos de genética reversa, um gene é mutado ou removido de alguma forma para identificar seu efeito no fenótipo de todo o organismo como uma maneira de determinar sua função.

Glossário

recozimento
em biologia molecular, o processo pelo qual duas cadeias simples de DNA ligam-se a nucleótidos complementares para formar uma molécula de cadeia dupla
biotecnologia
o uso de métodos artificiais para modificar o material genético de organismos vivos ou células para produzir novos compostos ou para executar novas funções
clonagem
a produção de uma cópia exata – especificamente, uma cópia genética exata – de um gene, célula ou organismo
eletroforese em gel
uma técnica usada para separar moléculas com base em sua capacidade de migrar através de um gel semi-sólido em resposta a uma corrente elétrica
Engenharia genética
alteração da composição genética de um organismo usando os métodos moleculares da biotecnologia
organismo geneticamente modificado (OGM)
um organismo cujo genoma foi artificialmente alterado
plasmídeo
uma pequena molécula circular de DNA encontrada em bactérias que se replica independentemente do principal cromossomo bacteriano; Plasmídeos codificam algumas características importantes para bactérias e podem ser usados ​​como vetores para transportar DNA para bactérias em aplicações de engenharia genética.
reação em cadeia da polimerase (PCR)
uma técnica usada para fazer várias cópias do DNA
DNA recombinante
uma combinação de fragmentos de DNA gerados por clonagem molecular que não existe na natureza
proteína recombinante
uma proteína que é expressa a partir de moléculas de DNA recombinante
enzima de restrição
uma enzima que reconhece uma sequência nucleotídica específica no DNA e corta a cadeia dupla de DNA nesse local de reconhecimento, muitas vezes com um corte escalonado, deixando fios simples curtos ou extremidades “pegajosas”
genética reversa
uma forma de análise genética que manipula o DNA para perturbar ou afetar o produto de um gene para analisar a função do gene
clonagem reprodutiva
clonagem de organismos inteiros
transgênico
descrevendo um organismo que recebe DNA de uma espécie diferente

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